透析技术自Thomas Graham 于1861年发明到现在已有一百多年的历史,它已成为生物化学实验室最简便,最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中,去除盐、少量有机溶剂、小分子杂质、样品浓缩和改变微量样品的缓冲系统等都要用到透析技术。
生物样品的透析只需使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状,将生物大分子样品溶液置入袋内,浸入水或缓冲液中,样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内,而盐和小分子等物质不断扩散透析到袋外,直到袋内、外两边的浓度达到平衡。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”,袋(膜)外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。
透析的动力是扩散压,扩散压是由横跨膜两边的溶质浓度梯度形成的。透析的速度同欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度、膜的面积和温度成正比,与膜的厚度成反比。升高温度可加快透析速度。为最大限度地保持生物大分子的活性,通常采用4℃透析。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等,但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜。目前较常用的是美国Union Carbide (联合碳化物公司)和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管,其截留分子量MwCO(即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量,缩写为MwCO)通常从700到数万不等。
商品化的透析袋可制成管状,其扁平宽度为6~50 mm不等。为防干裂,出厂前一般都经10%的甘油处理,透析袋中含有微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质,它们对蛋白质和其它生物活性物质有害,用前必须除去。新购进的透析袋必须经过处理才能使用。50%的乙醇煮沸1小时,再依次用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤,再用蒸馏水冲洗后即可使用。实验证明,50%乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于蒸馏水中,置4℃保存。若长时间不用,可加入适量的叠氮钠(NaN2),以抑制微生物的生长。干的透析袋弯折时易出现裂口,用时必须仔细检查。
经过处理的透析袋,使用时,一端用橡皮筋或线绳扎紧,也可以使用特制的透析袋夹夹紧,由另一端灌满蒸馏水,用手指稍加压,检查是否漏液,确证无误后,再用蒸馏水洗净,方可装入待透析样品。装入样品时通常要留三分之一至一半的空间,以防透析过程中,因透析样品中的小分子浓度较大,袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时,体积增加是正常的,有时甚至可达50%以上。透析可以使用烧杯、量筒和塑料桶等容器,容器的大小以20-50:1为宜。少量样品溶液的透析,可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管,以使透析袋沉入液面以下。
通常为了把握透析效果,有时需要对透析液中欲去除的小分子残留物进行分析,如甘氨酸、二甲基甲酰胺、甲醛、戊二醛、碳酸根、偶联剂等。小分子残留物的检测分析方法很多,如 (NH4)2SO4可用1%的BaCl2检查,NaCl、KCl等可用1%的AgNO3 检查。有些检测方法比较复杂,或需要一定的条件,如确有必要可参考相关文献资料。
为了加快透析速度,提高透析效率,除及时更换透析液外,还可使用磁力搅拌,还可以使用各种透析装置。使用者也可以自行设计与制作各种简易的透析装置。美国生物医学公司(Biomed Instruments Inc.)生产的各种型号的Zeineh 透析器,由于使用对流透析的原理,使透析速度和效率大大提高。
附:透析袋的处理
1. 根据需要,把透析管剪截成适当长度(10—20cm)。
2. 在大体积的2%(w/v)碳酸氢纳和1mmol/L EDTA(pH8.0)中将透析管煮沸10分钟。
3. 用蒸馏水彻底清洗。
4. 于EDTA(1mmol/L,pH8.0)中煮沸10分钟,
5. 或将透析管置盛有蒸馏水的烧杯内,高压蒸汽灭菌10分钟。
6. 冷却后,存放于4℃。透析管必须确保始终浸于溶液中。
7. 从此时起取用透析管时总须戴手套。
8. 用前将透析管用蒸馏水清洗干净后即可使用。
一、 膜技术参数:
①PH稳定范围 : 5-9
②污染物水平: 硫化物<0.3%; 重金属<50ppm
③化学兼容性: 与很多盐兼容,比如CaCl2, (NH4)2SO4;还可与分子生物学及酶学中常用的水溶剂、有机溶剂兼容,比如异丙醇、乙醇和丙酮。
④温度抵抗性:可煮沸,可高压灭菌。
⑤蛋白吸附:每克透析袋吸附蛋白量小于1ng 。
二、 储存条件:
未处理前的透析袋可存放于0-43度,密封包装好以防干裂;处理好暂时不用的透析袋需要放置到透析袋储存液中,并放于4-37度。
三、 透析袋使用方法:
①把透析袋剪成适当长度(10cm左右)的小段。
②取适量透析袋处理液(Fast-Tre Solution)稀释100倍,将透析袋放于其中煮沸10分钟。
③取出用蒸馏水彻底清洗透析袋。
④ 暂不使用的话需要将透析袋完全浸泡到稀释100倍后的透析袋储存液(Long-Sav Solution)中,存放于4度。从此时起取用透析袋是必须戴手套。
⑤浸泡在透析袋储存液中的透析袋取出使用前,须将透析袋内装满水然后排出,将之清洗干净,冲洗三次即可。
实验要求不高的可以用简易处理方法:在沸水中煮10min即可使用
⑥使用时,一端用下沉透析袋夹子夹紧,灌满水后,用手指适当加压,检查不漏,方可装入样品。通常要留三分之一至一半的空间,以防透析过程中,袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。装完样品后,用上浮夹子夹紧袋口,可在袋内放一玻璃珠,以使透析袋处于悬浮状态,即可进行透析(详见下页透析袋装置简图)。为了加快透析速度,除多次更换透析液外,还可使用磁力搅拌器。透析的容器要大一些,可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。
一、透析的定义:
透析(dialysis)是指物质穿过膜的选择性扩散过程。可用于分离分子量大小不同的溶质,低于膜所截留阈值分子量的物质可扩散穿过膜,高于膜截留阈值分子量的物质则被保留在半透膜的另一侧。
二、透析袋:
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状,就叫做透析袋。在生物大分子的制备过程中,除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。比如蛋白质和DNA的脱盐浓缩,纳米材料的筛选,中药成分萃取后有机溶剂的去处等。
三、透析方法
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状,将生物大分子样品溶液置入袋内,将此透析袋浸入水或缓冲液中,样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内,而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外,直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”,袋(膜)外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。通过多次更换透析液而去除盐和小分子物质
四、我们的产品
我们所提供的普通透析袋及CE膜和RC膜透析袋已经被广泛的应用于蛋白质、核酸脱盐浓缩实验,纳米材料的筛选,萃取后中药成分中有机溶剂的去除,污水处理,抗体制备等实验。
透析即用半透膜(透析袋)将大分子蛋白质分离出来。
在生物大分子制备过程中除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品,透析法最简便。
技术指标:MWCO(截留分子量),单位:Diatoms 。
透析时,小于MWCO的分子在透析膜二边溶液浓度差产生的扩散压作用下渗过透析膜,
其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。
欲快速透析可采用直径较小的透析袋以增加膜面积。
常用温度:4℃,升温、更换袋外透析液或用磁力搅拌器,均能提高透析速度。
使用须知:
① 某些化学物质会破坏透析袋微孔且不可逆转。计有:
烃、卤化烃、醇、酮、酯、胺、丙酮、甲基乙基酮、二氧杂环乙烷、环已烷等。
酸(甲酸、乙酸、稀强酸如5%HCI),10%苯酚,30%双氧水。
甲醇、乙醇:浓度小于5%时,透析功能在,而MWCO变化。
② 蛋白质吸附量,小于1ug/克,(以透析袋干重计)。 正常使用PH值5-9(可重复使用)。极限使用PH值2-12(一次性使用)。
③ 前处理:煮沸5分钟后用蒸馏水60℃洗冲2分钟,置4℃蒸馏水中待用。
长期保存液:0。05%-0。1%叠氮钠,1mMEDTA或50%甘油,温度(4℃),使用前以蒸馏水洗净。
④ 即用型透析袋毋须前处理,使用前用蒸馏水洗净即可。
⑤ 透析袋装液时应留1/3-1/2空间,以防透析过程中,袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破
(含盐量高的蛋白质溶液透析过夜时,体积增加50%系正常情况)。
⑥ 使用时须戴手套。
⑦ 透析效果检查用 1%氯化钡 检查硫酸铵、硫酸钠1%硝酸银 检查氯化钠、氯化钾。